如何培养冬虫夏草菌种回到我的E-MAIL那里

如何培养冬虫夏草菌种回到我的E-MAIL那里
如何培养冬虫夏草菌种
回到我的E-MAIL那里

如何培养冬虫夏草菌种回到我的E-MAIL那里
冬虫夏草,又称为夏草冬虫,简称虫草.全世界目前已报道发现由虫草属真菌Cordyceps寄生于昆虫、蜘蛛和其他生物长出子实体的虫草种类达400多种；我国已记录68种.在国内外一些人和学者的概念中,把凡是由虫草属真菌寄生并能产生子实体的菌物结合体都通称为冬虫夏草.然而,中国传统的中医药学和我国绝大部分学者和人们及本文所指的冬虫夏草,是特指仅分布于我国青藏高原及边缘地区高寒草甸中的中华虫草菌Cordyceps sienesis (Berkeley) Saccardo (1878)寄生于昆虫纲、鳞翅目、蝙蝠蛾科、蝠蛾属Hepialus幼虫感病后形成的虫、菌结合体;；而其他类群仅称为虫草,不是正宗的冬虫夏草.
一、冬虫夏草和寄主昆虫的药用历史及发展现状
药用冬虫夏草,最早的文字见于清朝汪昂的《本草备要》(1694)所载："冬虫夏草,甘平,保肺益肾,止血化痰,止劳咳.四川嘉定府所产者佳.冬在土中,形如老蚕,有毛能动,至夏则毛出土上,连身俱化为草.若不取,至冬复化为虫.后来,赵学敏的 《本草纲目拾遗》(1756)一书中记载："夏草冬虫,功与人参同,能治诸虚百损",该书还对冬虫夏草的产地、食用方法和用量有详细的记述.1757年吴仪洛所著的 《本草从新》一书也指出：“冬虫夏草保肺益肾、止血化痰.”其后 《黔囊》、《文房肆考》、《四川通志》、《本草图说》等数百部古药书中都记载了冬虫夏草.
我国把冬虫夏草作为药材出口到国外的历史比文字记载的更悠久.从明代中叶1400一1465年间就从浙江传到日本,并在贵族中广泛食用.1723年由欧洲的传教士尚加特利茨库把从中国西北采到的冬虫夏草带到法国,由Reaumur在法国科学院的学士大会作了介绍,并登在会议纪要上；1943年,Berkeley鉴定了中国的冬虫夏草,正式定名为：中国虫草Sphaeri sienesis；1878年由Saccardo归为虫草属Cordyceps,冬虫夏草的研究在国外引起重视,中国虫草也开始驰名于世.
冬虫夏草由于仅分布于中国,又是数百年来我国和亚洲人民视为与天然人参、鹿茸相媲美的名贵滋补中药材,享有极高的声誉.它药性作用温和,比其他种类的滋补品更具有广泛的药用和食用性,长期以来是我国既可药用又可食用的高级滋补品,并且一年四季都可食用,对老、少、病、弱、虚者皆宜服用,无任何副作用.古代70多部中药学文献把冬虫夏草的功用归纳为:"能阴阳并补,治劳嗽膈症,诸虚百损；功与人参、鹿茸同,但药性温和,老少病虚者皆宜食用……."新中国建立以来,我国有200多部药书详细记载了冬虫夏草的药效与用途,历部 《中华人民共和国药典》记载其功用为："补肺益肾,止血化痰.用于久咳虚喘,劳嗽咯血,阳痿遗精,腰膝酸痛."随着国内外医学的发展和中药学在全世界逐步普及,近年来发现冬虫夏草的功用效果越来越广泛.经研究证明,它是具有镇静,止血,抗惊厥,降压,改善心肌缺血,抗血小板凝结,抗衰老,调节人体免疫和具有抗肺癌、淋巴癌和肝癌功能的药物.目前越来越引起国内外药学界和生物学界研究者的重视,有关研究报道大量增加.
最早科学地描述和发表我国青藏高原有蝠蛾属昆虫分布是英国的Poujade1886年在四川省的宝兴县雪山上发现一种蝠蛾,被他定名为德氏蝠蛾Hepialus davidi；后来Alphe raky、Staudinger等学者分别于1889和1895年在西藏发现了暗色蝠蛾H.nebulosus（同种异名：泥色蝠蛾H.luteus)、异色蝠蛾H.varians两个种类.1909年Oberthur在法国的Armorica半岛上整理由中国西藏、四川带去的药材和植物标本中,发现一头蝠蛾成虫,并以该半岛名称定名为H.armoricanus,但在发表新种时说明,该种蝠蛾产地可能是中国川藏高原,因在半岛一直未再发现有该种蝠蛾分布；后来一直到1959年中国科学院动物研究所科研人员在四川康定等地采到大量的蝠蛾成虫和幼虫,经朱弘复鉴定,与在法国Armorica半岛发现的蝠蛾是同一种,从而定名为虫草蝙蝠蛾,并确定为中国特产的冬虫夏草菌的寄主昆虫之一.到目前为止,在青藏高原及边缘地区已发现中国特有的冬虫夏草菌寄主昆虫37种.
二、冬虫夏草与蝠蛾昆虫人工培育和产业化现状
（一）有性型冬虫夏草人工培育现状
冬虫夏草人工培育在近20年来全国先后有60多个科研单位和数千人进行了大量的研究、实验和探索；云南、四川等地已在高海拔地区取得了小面积培育有性型成功的经验,但由于周期长,高海拔地区无推广对象、投资大、效益不如自然采集的高等多种因素,一直未能大面积推广.在云南、四川、浙江、甘肃、青海、北京、福建、广东、贵州、广西等省(市、区)中低海拔地区,开展人工培育有性型冬虫夏草研究也有多年,虽然在某一些环节上已有多家取得了十分可喜的成绩或成果,如云南和四川等省已在昆明、成都和重庆的室内人工批量、重复繁殖成功蝠蛾昆虫；浙江等地在室内零星繁殖成功蝠蛾昆虫;但由于没有解决虫与菌接种和批量、重复长出子座体的难关,不能称为培育成功.离小面积、小批量、多次重复在低海拔人工培育出有性型冬虫夏草的目标都还十分遥远；虽然数家已声称在中、低海拔批量培育成功有性型冬虫夏草,事实上科学的可信度极低.因为：
(1)目前还无一家能长期又稳定地分离培养到正宗的冬虫夏草真菌 (即反复在培养基上批量长出子座).青诲、云南、四川、北京等地在培养基上都培养出过子座,但其子囊孢子稀少或无子囊孢子,而且生长都不稳定,不能说明已掌握了有性型人工在中低海拔的培育技术.
(2)冬虫夏草菌无性型人工培养技术比较容易掌握,在室内接种到蝠蛾幼虫上也能感染成为僵虫期,但确罕见有完成有性型,长出子座体和子囊孢子.
(3)目前子座的形成除了海拔、气候、土壤、气压等多种环境因素外,其菌之间是否多菌复合感染?如果是复合感染,又是哪一些菌在起关键作用?在什么时期与冬虫夏草菌起作用?等等问题尚不清楚.
因此,要在中低海拔地区人工批量和重复培育出有性型的冬虫夏草,还需做大量的研究和实验工作.就是在高海拔地区进行大面积人工培育冬虫夏草,也还需开展许多技术性的实验工作.所以有性型冬虫夏草人工培育要达到规模化或产业化生产,研究还十分艰巨,路程还非常遥远.
(二)无性型冬虫夏草人工培养现状
由于有性型冬虫夏草的人工培育困难太大,近10多年来,大部分开展冬虫夏草人工培育研究的单位和研究人员都纷纷转向无性型的研究与应用上.由于虫草菌无性型培养技术容易掌握,而且从自然界采集冬虫夏草分离出来的真菌,绝大部分理化性质和药理功能与冬虫夏草的有性成分相似,所以各地都把自我分离出的真菌确定为冬虫夏草菌的无性阶段,并纷纷建厂生产菌粉和开发应用.目前已从自然界的冬虫夏草体中分离出自我认为是中华虫草菌无性型共有9属31种,其中有16种已经在北京、吉林、山西、上海、青海、浙江、福建、江西、广东、云南、贵州等19个省 (市)40多家,进行深层大规模发酵培养和固体培养菌丝体和分生孢子体作为有性型冬虫夏草的代用品,部分厂家已进入大的产业化生产,如至灵胶囊、金水宝胶囊、宁心宝胶囊、心肝宝、冬虫夏草鸡精、虫草胶囊、冬虫夏草酒、冬虫夏草人参补酒等20多种产品年产值均达千万元至数亿元.而且,由于用菌丝体和分生袍子人工繁殖周期短、产量高,今后作为冬虫夏草有性型的代用品,开发、应用的潜力还极大.
三、冬虫夏草和蝠蛾昆虫人工培育技术
(一)冬虫夏草茵的寄主昆虫饲养繁殖技术要进行冬虫夏草的人工培育,首先必须大量人工饲养寄主一一蝠蛾属昆虫.蝠蛾一生中有98%的时间都在土壤内生活,仅有2.5一13d的成虫期营地面生活.所以,这类昆虫的人工饲养管理主要是在土壤中开展.
1.蝠蛾的饲养工具
(1)蝠蛾卵的饲养工具.饲养蝠蛾卵可用两种方法,一是用直径15一20cm的玻璃培 养皿,垫上2一3层滤纸,皿内放一块吸水棉保持湿度,每皿可饲养200一500粒卵.此法利于观察,但难掌握湿度.二是用l0cm xX5一8cm的广口瓶或者25cm x 30cm的玻璃饲养 缸,内置3一5cm厚的过筛细腐殖土,种上1一2棵珠芽寥植物,把卵放养于土表至lcm深的土层中,每瓶可饲养300一1000粒卵；饲养时只要掌握住植物不枯萎,即可不加湿度.此法卵的孵化率高,但观察和移植幼虫对比较困难.
(2)幼虫的饲养工具有以下4种.
a.玻璃养虫缸：用18一25cmX30一35cm的玻璃缸,也可用标本浸泡缸,放置土壤15一25cm,种上幼虫取食的植物,把刚孵化幼虫移入缸内,每缸可饲养10一30头幼虫.
b.地下养虫箱：箱一般高30一50cm,宽20一25cm,厚3一5cm.饲养箱骨架用钢筋 焊成,上面钢筋做成提手,便于提动；宽的两面用3一5mm玻璃,便于观察虫体活动；底 和两个侧面装上16孔目的铜纱网,便于水分渗入.然后装上土壤,种植饲料植物,每箱放养20一50头幼虫；在较坚实的地上挖一个比饲养箱体积稍大和深的槽,把养虫箱放入槽中,观察时将养虫箱提出地面,抹去外表玻璃上的土壤,即可清楚看到幼虫活动情况.
c.大型养虫笼：在半自然的状况下,选择一块排水好、土质疏松的场地,挖长12一l5m、宽2一3m、深4Ocm的深槽,底部和四周垫上尼龙纱网(最好用双层,小虫不易钻出),再把疏松的腐殖土铲进填平,种上幼虫食物,放入幼虫饲养,每平方米可放养30一50头；该法有利于大规模饲养,但观察困难.
d.用各类盆具裸露饲养：把植物饲料洗净放入盆中,放入幼虫饲养,盆口覆盖一层黑布或者黑纸遮光.此法利于生活史观察,但要注意勤换饲料和清除粪便.
(3)蛹和成虫的饲养工具.制作长50cm、宽50cm、高55一60cm的养虫箱.底部用薄铁板或双层铜纱网封底；顶和四周用铁纱或尼龙纱封盖,前面可制成一道活动纱网门.在箱底放入10一20cm的土壤,种上植物,把蛹和成虫放养土中,此法可进行密植饲养.
2.饲养技术要点
(1)土壤的选择.土壤是蝠蛾昆虫一生中最主要的活动场所.土壤条件是否适合该虫生活是人工饲养成活率高低的关键之一.最适宜蝠蛾生长的是高山草甸土；次之是流石滩和草甸混合土；再次之是高山棕色、暗棕色林土,其他土壤对此虫生长不良.
(2)食料的选择.幼虫最喜取食圆穗蓼、珠芽蓼、黄芪、小大黄等植物的嫩根芽.由于蝠蛾昆虫是一类杂食性昆虫,在无上述植物的地方,可用禾本科 (如青稞、麦、谷芽等)；十字花科、莎草科的嫩根饲养.在中、低海拔地区(适宜生活的温度下)用土大黄、胡萝卜、白萝卜、白薯 (红苕)、马铃薯、苹果等饲喂也能正常生长发育,最好为土大黄、胡萝卜和白薯三类.
(3)温、湿度的选择.蝠蛾昆虫是一类耐低温而怕高温的昆虫.最适宜在15一19C中生活成长；此虫最适宜空气湿度75%一85%,土壤含水量40%一45%之间.
3.管理技术
(1)成虫期.成虫不取食任何食物,只要保持水分和适宜温度即能正常成活和产卵.但蛾子栖息环境与产卵量有关.成虫最喜选择有杜鹃和蝠蛾幼虫取食的蓼科等植物根旁产卵,所以在蛾子交配产卵前植上几株相关植物最佳；另外不能有强光影响.
(2)卵期.要使卵能正常孵化,一定要掌握好适宜的温、湿度.
(3)幼虫期.幼虫由于生长期长,而且虫体壁薄而易破,饲养时一定要细心,除了必要的观察、换土和换食料外,尽量减少翻动.幼虫的饲养关键是初孵的幼龄时期,初孵幼龄虫要给足细小鲜嫩、湿度不高的食物；土壤最好经过筛检,以免粗硬物擦伤主体.此外,为了延长食料和土壤不霉坏,更换前用紫外灯照射杀菌l5min,土壤也可在阳光下暴晒1一2h后再用.
(4)蛹期.养蛹时,把养蛹器皿内的土壤压实,然后用与蛹粗细的木棍人工造一土室,土室略斜,深约2一3cm,每室放一蛹,放蛹时,蛹头向土表面,上用细土盖住.蛹的温湿度,可控制在大气湿度80%一85%,土壤含水量42一45%之间,温度18一22℃之间.
[二]冬虫夏草菌的人工培养技术
要获得纯正的冬早夏草菌种必须进行人工的分离、纯化、复壮、保存等工作.
1.分离冬虫夏草菌的技术与条件
(1)材料要求.获得纯的菌种对材料要求比较严格；一般来说如果是进行冬虫夏草的组织块分离法,最佳的分离材料是每年的10月底至11月份,青藏高原高寒草甸土壤刚开始冻结时期采的材料,这个时期冬虫夏草菌刚感染蝠蛾幼虫进入僵虫期不长时间,嫩小的子座芽刚长出虫头部0.2一0.5cm,虫体内其他杂菌较少,最易进行分离.如果是第二年5一6月份采的材料,僵虫体和子座上都有许多种杂菌共生或腐生,难获得纯菌种.若用子囊孢子进行分离培养,材料最好在每年的7月中、下旬子囊孢子刚有部分成熟期采集分离培养.
(2)操作方法.有以下3步.
a.僵虫体 (即菌核)的分离：分离前,用水刷洗干净主体表面,再用无菌水清洗2一3次；用0.1%一0.2%的升汞溶液,对分离材料进行约3一5min的表面消毒；再用无菌水清洗.选取与胸足为界的前段部分.用解剖刀切去表皮,避开消化道,取血腔菌丝切成芝麻粒大小,压入平板培养基中,每皿1一2粒.置于15一19℃中培养,待菌落长出0.2一0.5cm时,挑选少量菌丝反复在平板培养基上分纯2一4次,确定无其他杂菌后,移入试管保存和培养.
b.子座芽分离：从僵虫头顶切下洗净的子座芽,置入0.1%升汞液中消毒2一3min,用无菌水洗净,切取中间部位组织块压入培养基中；培养条件同a.
c.子囊孢子分离：用透明纸袋套住子囊孢子成熟的子座,让子囊孢子弹跳粘贴在纸袋上,然后,把有子囊孢子的纸袋浸入25%的葡萄糖液中,洗下孢子,放入15一19℃中培养,每天镜检,当袍子萌发时,用微吸管吸单个孢子滴于平板中培养；培养条件同a.
也可把整个成熟的冬虫夏草带回室内,用棉纸把僵虫和连虫体的子座包住,仅留出有孕部分,在无菌室中,横放,下置一片载玻片,随时保持主体湿度；每天镜检,当看到子囊孢子弹到玻片时,用微吸管吸到平皿的培养基中培养；培养条件同a.
(3)培养基的选用.
a.马铃薯葡萄糖琼脂培养基 (PDA),此种配方是所有虫草菌属真菌的通用培养基,在分离培养初期可用该配方,不过菌种生长不十分旺盛,而且易老化、退化.
b.加富培养基 (1)：多性蛋白脐10g,葡萄糖50g,磷酸氢二钾1g,硫酸镁0.5g,活蚕蛹30g,生长素0.5μg,琼脂20g,加水1000mL,pH：5.0.
加富培养基 (Ⅱ)：蛋白脯40g,葡萄糖40g,去皮鲜马铃薯100g,磷酸氢二钾1g,硫酸镁0.5g,牛肉膏10g,生长素0.5μg,蝠蛾活幼虫 (磨碎)30g,琼脂20g,高寒草甸土浸出液10OOmL,pH：5.0.
在加富培养基上,菌落比在PDA培养基上生长旺盛和迅速；加富Ⅱ号又优于Ⅰ号.
2.生长特性 冬虫夏草菌的分离培养中须掌握温度、pH值、光照、碳和氮源及无机盐的利用状况.
(1)不同温度对菌丝生长的影响.冬虫夏草菌喜偏低温度.在0一4℃时能缓慢生长；5一8℃时生长速度加快；10一19℃是此菌较适生长发育的范围;最佳生长温度为15一l9℃.超过20℃菌丝猛长,菌落由白色变为灰黑或棕黄色,开始出现变异,所以不宜高温培养.
(2)对pH值的要求.冬虫夏草菌是一种偏酸性真菌,最适pH值为5.0一6.0,当pH值为4.5以下和6以上时,随着增高或降低,生长缓慢至不生长.
(3)光照的影响.此菌的子囊孢子萌发和菌丝生长初期,适应于弱光和短光照,后期则适应于较强光照.在人工培养中,菌丝、分生孢子和子座等具有明显的趋光性,向阳面生长多而密,背光面生长稀疏,全黑环境下培养的各种菌态纤弱、细长、稀疏.
(4)对碳源的利用.冬虫夏草菌可利用多种碳源,但以葡萄糖和麦芽糖合用时生长最快,单用葡萄糖时也能良好地生长,次之是马铃薯等淀粉,再次之是蔗糖.
冬虫夏草菌是一种由寄生活体寄主,再由腐生阶段发育成熟的真菌,所以对氮源中的多种有机氮均能较好的利用.而以活虫体最佳；蛋白胨与酵母膏合用生长也十分理想,次之是二者单独使用,再次之是牛肉膏等.而对无机氮如硫酸铵、硝酸钾等利用较差.
对灰分养料有一定的需求,在有微量的硫酸镁、磷酸氢二钾的培养基中生长旺盛,次之是磷酸二氢钾,其他钠、钙、铁、铜等无机盐也可利用.
3.培养方式 冬虫夏草菌分离纯化后,即可作为各种实验和扩大生产应用.
(1)其扩大生产的方法常有三种：固体静置培养法、振荡培养法和大罐通气发酵培养法.
a.静置培养：主要用在固体培养,如试管斜面、三角瓶培养、米饭培养等等.在静置培养中只要掌握好温度和光照即可使菌正常生长.当斜面上的分生孢子成熟后,即可存入1一2℃的冰箱中保存8一14个月,也可作为种子直接用于生产.
b.振荡培养：采用液体培养菌种或小规模繁殖培养,都可用振荡培养.振荡培养的培养基,把固体培养基减去琼脂即可.设备最好选用恒温振荡培养机,用三角瓶置液体培养基,把试管固体菌种接入即可培养.经不断振荡使液体培养基中各种成分混合均匀而不致沉淀,同时促进气体与液体接触和交换,使氧进入液体培养基中,利于菌丝生长和分生孢子形成.
c.大罐通气发酵培养：在大规模生产菌丝和分生孢子等菌粉时,必须用大罐通气发酵培养法.该方法通气是采用吸气或真空泵减压等方法,经过滤器除杂菌,送入罐内液体培 养基中供冬虫夏草菌的生长发育.
(2)发酵工艺流程.自然冬虫夏草分离纯化→ 试管斜面种→ 振荡器液体一级 种→ 二级种→ 小型种子发酵种子罐→ 生产发酵罐 → 浓缩→ 喷粉干燥→ 成品菌粉.
冬虫夏草菌罐中发酵要求温度在20一25℃,罐压392.3一686.5kPa(0.4一0.7kg/cmz),通气量为0.5一1.OVVm*；注入发酵罐中的液体培养基为罐容的65%一75%为宜. 接种量为10%,搅拌速度为180r/min,培养时间72一96h,即可放罐浓缩和喷粉.
(3)发酵培养基多用.鲜马铃薯 (去皮)8%,蔗糖2%,玉米淀粉0.5%,蚕蛹粉1%,蛋白胨0.4%,硫酸铵0.2%,pH值5.5一6.0.
(4)发酵培养成品标准.分生孢子即几全脱落母体孢子梗,孢子梗数量增加不明显 时,在镜下计数检查,每毫升含分生孢子18亿一25亿个；残糖低于1%；氨基氮低于0.2mg/mL,即可成为成品菌液.
4.冬虫夏草菌回接要点 把有性型或无性型的冬虫夏草菌孢子回接到寄主昆虫体上,是人工培养有性型冬虫夏草和复壮无性型菌种的关键措施.
(1)回接时期.冬虫夏草回接关键在于选择寄主昆虫抗菌薄弱时期,一是蜕皮期；二是幼虫取食活动激烈,摩擦损伤率较高时期.
(2)回接方法.又分两种.
a.喷雾法：当饲养的蝠蛾幼虫达4一6龄虫,有1/3以上的幼虫蜕皮时,把幼虫集中,用子囊孢子或者分生孢子对入5%一10%葡萄糖液喷雾到虫体或食物上,接种后约30min,菌液在虫体上略干,把幼虫放回土壤中任其自然生活.此法感病率高,但缺点是,幼虫不易从土中取出集中,而且集中时幼虫有互相残杀的习性,虫体被咬伤后,易被杂菌感染致死,冬虫夏草菌丝未充满体腔时,伤虫就会腐烂,不能形成僵虫 (菌核).
b.自然接触法：在大面积半自然土壤中饲养蝠蛾幼虫,定时取小样观察幼虫生长状况,当大部分幼虫适宜感病时,用饲料植物浸菌液种植和用细土拌菌接种,均匀撒入养虫的地表上,然后喷水,使菌渗入土中,幼虫取食活动时接触感染.此法寄主感染率不太高,但一经感染致病,冬虫夏草菌长势好,而且未感病的蝠蛾幼虫能正常生长,繁殖后代.