作业帮双酶切老是切不完全我PCR克隆了一段200bp的基因片段,然后连接到了T载体,引物2端各有EcoRI和HindIII的酶切位点,但现在将T载体进行双酶切,缺总是切不完全,只有大约1/3的载体被切开,所以200bp的条
来源：学生作业帮助网 编辑：作业帮 时间：2024/11/27 23:02:22
双酶切老是切不完全我PCR克隆了一段200bp的基因片段,然后连接到了T载体,引物2端各有EcoRI和HindIII的酶切位点,但现在将T载体进行双酶切,缺总是切不完全,只有大约1/3的载体被切开,所以200bp的条
双酶切老是切不完全
我PCR克隆了一段200bp的基因片段,然后连接到了T载体,引物2端各有EcoRI和HindIII的酶切位点,但现在将T载体进行双酶切,缺总是切不完全,只有大约1/3的载体被切开,所以200bp的条带很淡.我的酶切体系是30ul 2种酶各1ul 然后10ul质粒,37度酶切2小时.我确定酶和buffer都没有加错,但为何老是切不下基因呢?
双酶切老是切不完全我PCR克隆了一段200bp的基因片段,然后连接到了T载体,引物2端各有EcoRI和HindIII的酶切位点,但现在将T载体进行双酶切,缺总是切不完全,只有大约1/3的载体被切开,所以200bp的条
Best reaction for EcoRI is high slat buffer,while HindIII is low salt buffer.Many companies will tell you HindIII would not work well in high salt buffer.I would use high salt buffer,such as New England Buffer 3,for your digestion.Usually it works pretty well.Do not worry too much about HindIII,in most cases you include much much more than necessary enzyme for the restriction.
Good luck.
首先，你看你的载体片段和目标片段的亮度比是不是大约10倍（因为一般T载体大小在2.5K~3k左右），如果是的话，那是正常现象。
如果你能看见线性化的载体或没有切开的载体，那么建议你换一下新开封的酶试试。