什么是pfu扩增

来源：学生作业帮助网 编辑：作业帮 时间：2024/11/03 04:21:16
什么是pfu扩增
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什么是pfu扩增
什么是pfu扩增

什么是pfu扩增
Pfu是DNA扩增过程中,保真性最高,出错率最低的高温DNA聚合酶.基因片段用Pfu扩增得到的产物为平末端,直接克隆比较困难.
DNA PCR扩增 ：
用Pfu进行高保真PCR扩增,50ul反应体积,一般扩增25-30个循环,2.5 U Pfu DNA Polymerae.Pfu DNA聚合酶的使用与Taq DNA聚合酶的使用方式基本相同
注意事项：
（1）Pfu扩增效率通常比Taq酶差,这是由于Pfu具有3’-5’的外切酶活性（高保真性）所引起的,不是由于Pfu酶的质量不稳定所致.Pfu在扩增2kb以下的DNA片段和Taq没有多大差别.
（2）10× Pfu PCR Buffer中已含有Mg2+,用该缓冲能保证扩增产物的保真性.提高反应体系的pH和Mg2+浓度能部分提高DNA扩增的产率,但产物的保真性将有所下降.不提倡用Taq PCR反应缓冲代替Pfu缓冲做高保真扩增.
（3）用Pfu扩增时,引物的纯度要求较高,长度要求大于18 base,Tm在55-80℃之间.引物的浓度在0.1-0.5mM之间,比Taq略高.Pfu具有3’-5’的外切酶活性可能会降解引物,特别是溶液中没有dNTP的情况下.所以,Pfu必须是最后加入到反应体系中,并立即进行PCR反应.
（4）Pfu的热稳定性比Taq酶高,对于GC含量很高的模板,变性温度可以提高到98℃,而不会影响Pfu的活性.

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