生工引物合成,上海,

来源：学生作业帮助网 编辑：作业帮 时间：2024/11/15 07:39:02
生工引物合成,上海,
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17.长链引物为什么出错的几率非常高?
答：引物合成时,每一步反应效率都不能达到100%,产生碱基插入,缺失,置换突变的因素客观条件都有一直存在.引物链越长,突变的频率累加起来就越高.研究人员总希望合成的引物万无一失,这种心情可以理解.但是犹如PCR扩增,不可能绝对保证扩增产物中没有突变,引物合成也不可能保证100%正确.要知道,引物合成中发生错误（非人为因素）的频率,比任何高保真高温聚合酶PCR扩增过程所产生的频率都要高.做引物合成,长链引物合成,您要有引物中部分引物可能有突变的思想准备.

18.如果测序发现突变,该如何处理?
答：对您遇到的困惑,我们表示同情.遇到这种情况,首先和我们取得联系,我们的生产人员会检查生产的原始记录,主要是核对合成序列是否和定单一致,我们在电脑中保留所有原始数据.如果确认引物合成序列没有输错,我们建议重新挑取克隆测序,您可能会找到正确克隆的.根据我们经验,40个碱基以下的引物,测1-2个克隆就可以了；40个以上的特别是用于全片段拼接合成的,就需要多测一些了.一般情况下,每个克隆突变的位点都不一样,提示正确的总是有的,就是如何找到它.您也可以要求我们将引物免费重合一次,不过重合的引物和第一次的引物一样,都可能含突变,不会因为重合的引物就减少您的遇到问题的几率.基因拼接过程中,如果发现一段区域突变点不多,就多测几个,否则就重合一下引物.

19.如果测序发现引物突变,是否有补偿?
答：没有.我们可以免费重合一次,没有其他任何补偿或赔偿,不承担其他连带责任.原因我们在前面已提到,化学合成效率不可能达到100%.您选择了化学合成引物,合成过程中一些副产品所带来的后果就可能不可避免的遇到.

20.引物是经过PAGE纯化的,为什么还有碱基缺失或插入?
答：理论上分析型PAGE变性电泳,可以区分引物之间一个碱基的差别.但是制备PAGE电泳,上样量都是非常大,电泳时的条带非常宽,带与带之间有重叠,分辨率已下降,电泳后割带回收目的引物时,很难说不割到差别仅几个碱基的引物.国内有一个不好的现象,PAGE纯化的引物,特别是长引物要的量都比较高,导致割的条带有时可能比较宽.建议：您如果减少OD数,引物遇到的问题可能就会少一些.

21.为什么OPC或PAGE纯化的引物,再用HPLC鉴定纯度不高?
答： 有些用户引物需要纯度特别高的引物,在使用前会将HPLC鉴定引物的纯度,常常发现引物的纯度一般在70%左右.问题来了,还有那30%是什么? 引物纯化PAGE, 需要电泳,用缓冲液将引物浸泡出来,然后用C18浓缩,乙醇沉淀.沉淀得到的核酸物质基本引物了,除此以外,还有其他一些非核酸类物质,他们一般不会干扰引物的使用.OPC纯化也类似的情况.即使是HPLC纯化的引物,如果对成品进行分析,一般也难达到很高的纯度,引物您得到的纯品都是由制备柱过来,洗脱峰经过浓缩抽干,部分非核酸物质被富集.

22.为什么修饰引物的产量要比一般引物低,价格要高?
答：主要因为是修饰单体稳定性较差,偶连时间长,效率低,最后得到的产量自然低于一般的引物.修饰引物通常需要PAGE或HPLC纯化,纯化过程损失大.修饰引物使用的原料是一般引物原料的几百倍,所以产品的价格自然高.

23. TaqMan 探针设计的基本原则是什么?
答：下列原则供您参考.
◆TaqMan 探针位置尽可能靠近扩增引物（扩增产物50-150bp）,但不能与引物重叠.
◆长度一般为18-40mer .
◆G-C含量控制在40-80%左右.
◆避免连续相同碱基的出现,特别是要避免GGGG或更多G出现.
◆在引物的5’端避免使用G.
◆选用比较多的碱基C.
◆退火温度Tm控制在 68-70C左右.

有用的荧光染料参数
Name Name 吸收波长 发射波长 colors
6-FAM 6-carboxy-fluorescein 494nm 518nm Green
TET 5-tetrachloro-fluorescein 521nm 538nm Orange
HEX 5-hexachloro-fluorescein 535nm 553nm Pink
TAMRA tetramethyl-6-carboxyrhodamine 560nm 582nm Rose
ROX 6-carboxy-x-rhodamine 587nm 607nm Red
Cy3 Indodicarbocyanine 552nm 570nm Red
Cy5 Indodicarbocyanine 643nm 667nm Violet

24.Primer设计的基本原则是什么?
答：引物设计的下列原则供您参考.
◆引物长度一般在18-35mer.
◆G-C含量控制在40-60%左右.
◆避免近3’端有酶切位点或发夹结构.
◆如果可能避免在3’端最后5个碱基有2个以上的G或C.
◆如果可能避免在3’端最后1个碱基为A.
◆避免连续相同碱基的出现,特别是要避免GGGG或更多G出现.
◆退火温度Tm控制在 58-60C左右.
◆如果是设计点突变引物,突变点应尽可能在引物的中间.

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