作业帮哪位秀友能介绍一下PCR-SSCP?
来源：学生作业帮助网 编辑：作业帮 时间：2024/11/05 18:30:25
哪位秀友能介绍一下PCR-SSCP?
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博凌科为-为你PCR 是 DNA 的聚合酶链式反应 ,SSCP 是单链构象多态性. SSCP 一般都要采用 PCR 扩增的方法进行检测 , 故名 PCR-SSCP .此项技术的原理是 , 不同序列组成的单链 DNA 或 RNA 在非变性聚丙烯散胶凝胶中电泳 , 会因其空间构象不同表现出不同的迁移率.因此 , 可以将基 因组中特定的 DNA 片段用 PCR 方法扩增 , 然后变性成为单链 , 在非变性聚丙烯酷胶凝胶中进行电泳 , 与对照的 DNA 片段进行比较 , 只要它们之间存在一个碱基的变异 , 就会表现出电泳行为的不同.显示不同 PCR 扩增片段电泳迁移率的方法 , 可采用漠化乙键染色或银染色 , 或用放射性同位素或荧光素标记在 PCR 引物上 , 然后进行检查 , 可提高分辨率. PCR-SSCP 分析技术在检测与疾病有关的单个碱基突变、连锁分析等方面极其有用. 在进行SSCP前首先要通过PCR扩增出特异性好的产物(琼脂糖电泳不能有过强的拖尾). (1)制备聚丙烯酰胺凝胶(PAG) 按上表制所需的胶液,将梳子插入模子,从梳子一端加入胶,当胶液快到梳齿时,使 模子向加胶端倾斜,继续慢慢加胶,边加边放端模子以防止气泡形成,室温放置1h使 之凝固.然后拔掉梳子,顶部加入1TBE封闭,备用. (2)电泳 取10lPCR产物,加入10l变性剂(95%甲酰胺,10mmol/LEDTA,0.02%溴酚蓝)、30l 石蜡油,煮沸5min,取出立刻放入冰浴中2min以上,然后将水相全部上样,10-15℃下 电泳.开始在300V电压下电泳5min,然后在120V电泳8h,取下凝胶,将其浸在含 0.5ug/ml溴化锭的1TBE缓冲液中染色30--45min,在紫外灯下观察,或进行银染. (3)银染法 将PAG板用去离子水洗二次,浸入10%乙醇和0.5%冰醋酸溶液固定6min.用去离子水洗 二次,再浸入0.2%AgNO3溶液中10min.用去离子水洗3--5次,然后浸入1.5%NaOH和 0.4%甲醛溶液中显色7min.最后,用0.75%NaCO3终止显色.