用CaCl2制备感受态细胞怎么总是失败我都是按照文献的步骤做的.最后用50ng/μl的DNA稀释10倍,取0.5μl去转化结果板上只长了不到10个菌落,为什么会这样啊?我已经做过很多次了都差不多~
来源:学生作业帮助网 编辑:作业帮 时间:2024/07/11 10:58:48
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用CaCl2制备感受态细胞怎么总是失败我都是按照文献的步骤做的.最后用50ng/μl的DNA稀释10倍,取0.5μl去转化结果板上只长了不到10个菌落,为什么会这样啊?我已经做过很多次了都差不多~
用CaCl2制备感受态细胞怎么总是失败
我都是按照文献的步骤做的.最后用50ng/μl的DNA稀释10倍,取0.5μl去转化结果板上只长了不到10个菌落,为什么会这样啊?我已经做过很多次了都差不多~
用CaCl2制备感受态细胞怎么总是失败我都是按照文献的步骤做的.最后用50ng/μl的DNA稀释10倍,取0.5μl去转化结果板上只长了不到10个菌落,为什么会这样啊?我已经做过很多次了都差不多~
1、 取大肠杆菌原始菌株(无外源质粒)单菌落接种于5mlLB培养液中,37℃,摇荡过夜;
2、 取1ml过夜培养物接种于100mlLB培养液中,37℃振荡培养1-3小时,待细菌达到对数生长期(OD600为0.5-0.6)即可;
3、 将培养液转移到两只预冷的50ml无菌离心管中,置冰上10分钟,使菌液冷却到0℃,JA-25.5转头(要预冷)5000rpm、4℃离心15min;
4、 弃上清,每只离心管加入10ml冰冷的0.1M无菌CaC12将菌体重悬,冰浴放置30分钟,JA-25.5转头5000rpm、4℃离心5min;
5、 每只离心管加入2ml冰冷保存液(1.7ml 0.1MCaC12和0.3ml无菌甘油)重悬沉淀,将两管混合,按每样200ul分装于无菌1.5ml离心管中;
6、 迅速放置于-80℃保存备用.
注意: 事先准备三个小瓶子,0.1M CaCl2 10ml/瓶 X 2、保存液 4ml X 1.
制备前一天准备好溶液并灭菌.超净台操作时不要用酒精灯或远离之.
楼主核对下~~任何疑问百度我
其实正如楼上所说 cacl2效果真的不咋样
用试剂盒吧。我们对比过CaCl2和试剂盒,CaCl2是很杯具的。。。
怀疑Call2的纯度,有条件可换用优级纯试剂
如果你觉得感受态没有问题,那么就先排除质粒和平板的问题。
转化效率的评估
我们建议转化(如下所述)不同浓度中等大小的质粒(约5kb)来评估转化效率,第一次检验,转化10-9,10-10,10-11g质粒DNA比较有意义。制备的最好的能达到108或更多克隆每ug质粒DNA,而达到5×106每ug质粒DNA可能已经适合做大多数的克隆了。另外,建议把自制的感受态涂到AP+KN板以排除污染...
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如果你觉得感受态没有问题,那么就先排除质粒和平板的问题。
转化效率的评估
我们建议转化(如下所述)不同浓度中等大小的质粒(约5kb)来评估转化效率,第一次检验,转化10-9,10-10,10-11g质粒DNA比较有意义。制备的最好的能达到108或更多克隆每ug质粒DNA,而达到5×106每ug质粒DNA可能已经适合做大多数的克隆了。另外,建议把自制的感受态涂到AP+KN板以排除污染有抗性的杂菌。
10.每个转化用200ul感受态,并将菌体冰浴。
11.加入连接物(5-10ul连接物/200ul菌液),小心弹匀后冰浴30min.
12.42℃热击30s(不用搅动)。
13.置于冰浴2min.
14.加800ul LB并在37℃振荡培养1h以使细胞恢复。
15.1000g离心,然后用200ul LB重悬并涂板,37℃培养过夜。
16.数菌落。如果你没有专门的数菌落的仪器,那么可在平板下垫一层黑色背景以便于观察菌落。用黑色钢笔在平板的底部标记数过的克隆。转化效率取决于10-6g质粒产生的克隆数量的多少。
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