热酚法抽提酵母RNA的实验目的,实验原理,老师的作业,纠结中.

来源：学生作业帮助网 编辑：作业帮 时间：2024/11/15 15:45:28
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目的：学习并掌握用热酚法抽提酵母RNA
原理：从细胞或组织中提取总RNA的试剂它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性,裂解细胞并释放出RNA,酸性条件使RNA与DNA分离,加入氯仿后离心,样品分成水样层和有机层.RNA存在于水样层中.收集上面的的水样层后,RNA可以通过异丙醇沉淀来还原.在除去水样层后,样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原.乙醇沉淀能析出中间层的DNA,在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白
步骤：步骤：1. 将酵母细胞培养在3ml选择性培养基中,30℃过夜旋转培养.
2. 稀释过夜培养的菌液,重新在10ml培养基中培养细胞.
3. OD600达到1.0时,收菌,4000rpm/min离心5min,弃培养基.
4. 将细胞悬浮于400μlAE缓冲液（50mMSodiumAcetate,10mMEDTA调整pH值至5.2）.
5. 加入1/10体积的10%SDS,充分混合.
6. 加入等体积在65℃预热的酸性酚（pH4.5）,混合.
7. 65℃加热5min,冰上放置10min.
8. 在室温下8000rpm/min离心10min.
9. 取水相,加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25∶24∶1）,10000rpm/min离心8min.
10. 取水相,加入等体积氯仿/异戊醇（49∶1）10000rpm/min离心8min.
11. 加入1/10体积3MpH5.2的醋酸钠,2.5倍体积的纯乙醇,-20℃过夜沉淀.
12. 沉淀样品于4℃离心5min,去除液体.
13. 在冰上干燥RNA（放置15min）,最后用适量DEPC水溶解RNA.

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