western blot和elisa用的二抗相同 为什么显色液不同我们实验室的westernblot和ELISA试验中使用的二抗都是汗HRP标记的二抗,同样的二抗,但是在显色的时候,westernblot使用的是DAB,ELISA使用的是TMB,请问为

来源：学生作业帮助网 编辑：作业帮 时间：2024/11/15 12:52:19
western blot和elisa用的二抗相同 为什么显色液不同我们实验室的westernblot和ELISA试验中使用的二抗都是汗HRP标记的二抗,同样的二抗,但是在显色的时候,westernblot使用的是DAB,ELISA使用的是TMB,请问为
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western blot和elisa用的二抗相同 为什么显色液不同
我们实验室的westernblot和ELISA试验中使用的二抗都是汗HRP标记的二抗,同样的二抗,但是在显色的时候,westernblot使用的是DAB,ELISA使用的是TMB,请问为什么同样都是辣根过氧化物酶标记,但是显色底物要使用不一样的呢?是否仅仅是因为固相载体不同呢?

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其实都是HRP催化底物反应,与固相载体无关,他们在反应的整个过程都起到了相同的作用－－供氢体
　　HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2)和供氢体(DH2).供氢体多为无色的还原型染料,通过反应可生成有色的氧化型染料(D).酶促反应的过程如下:
　　HRP
　　DH2＋H2O2────→D＋2H2O
　　目前用得较广泛和较满意的供氢体是：OPD(邻苯二胺)和TMB(四甲基联苯胺).
　　DAB(3.3－二氨基联苯胺)的反应产物为不溶性沉淀物,并有电子密度,故适宜于做免疫酶染色或电镜观察.
　　5AS(5-氨基水杨酸)早期曾用于ELISA,但其溶解度不够大,且空白孔不易控制到无色,现已很少应用.
　　OT(邻联甲苯胺)的特点是能产生鲜艳的蓝绿色产物且灵敏度较高,但反应中受温度影响较大,而且由于产物不稳定,需要在短时间内进行测定.
　　目前用得较广泛和较满意的供氢体是：OPD(邻苯二胺)和TMB(四甲基联苯胺).前者形成的产物为深桔黄色或棕色,后者产物为蓝绿色,二者的可溶性均好,在避光处颜色稳定,空白可近于无色,灵敏度上据报道后者比前者可高4倍以上.
　　另外,还有一种供氢体称ABTS[2, 2'-边氮基-双(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸)],其反应产物呈蓝绿色,且灵敏度和稳定性均好.尤其是在致癌的潜在可能性方面,ABTS与TMB皆是值得被优选的供氢体.

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