检测细胞凋亡的方法有哪些?

检测细胞凋亡的方法有哪些?
检测细胞凋亡的方法有哪些?

检测细胞凋亡的方法有哪些?
一、形态学观察方法
　　1、HE染色、光镜观察：凋亡细胞呈圆形,胞核深染,胞质浓缩,染色质成团块状,细胞表面有“出芽”现象.
　　2、丫啶橙（AO）染色,荧光显微镜观察：活细胞核呈黄绿色荧光,胞质呈红色荧光.凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧,可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体.
　　3、台盼蓝染色：如果细胞膜不完整、破裂,台盼蓝染料进入细胞,细胞变蓝,即为坏死.如果细胞膜完整,细胞不为台盼蓝染色,则为正常细胞或凋亡细胞.此方法对反映细胞膜的完整性,区别坏死细胞有一定的帮助.
　　4、透射电镜观察：可见凋亡细胞表面微绒毛消失,核染色质固缩、边集,常呈新月形,核膜皱褶,胞质紧实,细胞器集中,胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象.
　　二、DNA凝胶电泳
　　（一）检测原理
　　细胞发生凋亡或坏死,其细胞DNA均发生断裂,细胞内小分子量DNA片断增加,高分子DNA减少,胞质内出现DNA片断.但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间,出现180－200bpDNA片断,而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断,利用此特征可以确定群体细胞的死亡,并可与坏死细胞区别.
　　（二）结果判断
　　正常活细胞DNA 电泳出现阶梯状（LADDER）条带；坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带.
　　三、酶联免疫吸附法（ELISA）核小体测定
　　凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体.核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成,可由ELISA法检测.
　　（一）检测步骤
　　1、将凋亡细胞裂解后高速离心,其上清液中含有核小体；
　　2、在微定量板上吸附组蛋白体；
　　3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合；
　　4、加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合；
　　5、加酶的底物,测光吸收制.
　　（二）用途
　　该法敏感性高,可检测5*100/ml凋亡细胞.可用于人、大鼠、小鼠的凋亡检测.该法不需要特殊仪器,适合基层工作,但是不能精确测定凋亡细胞发生的绝多对量.
　　四、流式细胞仪分析
　　（一）检测原理
　　细胞发生凋亡时,其细胞膜的通透性也增加,但是其程度介于正常细胞与坏死细胞之间.利用一特点,被检测细胞悬液用荧光素染色,利用流式细胞仪测量细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞核凋亡细胞.
　　（二）应用价值
　　流式细胞仪检测具有以下特点：
　　1）、检测的细胞数量大,因此其反映群体细胞的凋亡状态比较准确
　　2）、可以做许多相关性分析
　　3）、结合被检测细胞的DNA含量的分析,可确定凋亡的细胞所处的细胞周期
　　■检测形态学及细胞膜完整性的Hoechs-PI双染色法
　　细胞发生凋亡时,其细胞膜的通透性液增加,但其程度介于正常细胞和坏死细胞之间,利用这一特点,被检测细胞悬液用荧光素染色,利用流式细胞仪检测细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞和凋亡细胞.
　　利用Hoechs-PI染色法,正常细胞对染料有抗拒性,荧光染色很浅,凋亡细胞主要摄取Hoecha染料,呈现强蓝色荧光,而坏死细胞主要摄取碘化丙啶（PI）而呈强的红色荧光.
　　■DNA片断原位标记法
　　凋亡细胞DNA片断原位末端检测技术是指在细胞（或组织）结构保持不变的情况下,用荧光素、地高辛或生物素标记的脱氧尿三磷酸（deoxyuridinetriphate,DUTP）和末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）相反应与凋亡细胞裂解后3.的羟基（－OH）端结合,经显色反应后检测DNA裂解点的技术.
　　DNA片段原位标记法有二种：
　　1、原位缺口转移（in situ nick-translation,ISNT）技术,它是利用DNA多聚酶I将标记的核苷酸连接到断裂DNA的3－OH端
　　2、原位缺口末端标记技术（in situ end labelling technique,ISEL）,即TUNEL法,它是利用TdT将标记的DUPT接到3－OH端.研究证明,TUNEL法的敏感性远高于ISNT,尤其对早期凋亡的检测,TUNEL为合适.
　　■检测细胞膜成分变化的Annexin V 联合PI法
　　1、原理：在细胞凋亡早期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（PS）迁移至细胞膜外测.磷脂结合蛋白V（Annexin V）是钙依赖性的磷脂结合蛋白,它于PS具有高度的结合力.因此,Annexin V可以作为探针检测暴露在细胞外测的磷脂酰丝氨酸.故利用对PS有高度亲和力的Annexin V,将Annexin V标记上荧光素（如异硫氰酸荧光素FITC）,同时结合使用PI拒染法（因坏死细胞PS亦暴露于细胞膜外测,且对PI高染）进行凋亡细胞双染法后用流式细胞仪即可检测凋亡细胞.
　　2、结果判断：正常活细胞Annexin V 、PI均低染；凋亡细胞Annexin V高染、PI低染；坏死细胞Annexin V/PI均高染.
　　3、应用价值：细胞发生凋亡时,膜上的PS外露早于DNA断裂发生,因此Annexin V联合PI染色法检测早期细胞凋亡较TUNEL法更为灵敏.又Annexin V联合PI染色不需固定细胞,可避免PI染色因固定造成的细胞碎片过多及TUNEL法因固定出现的DNA片段丢失.因此,Annexin V联合PI法更加省时,结果更为可靠,是最为理想的检测细胞凋亡的方法.