怎么检验饮料中的大肠杆菌?请把检验的步骤、药品、器材,尤其是该配个什么样的培养基?急用!

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怎么检验饮料中的大肠杆菌?
请把检验的步骤、药品、器材,尤其是该配个什么样的培养基?急用!

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样品制备：
以无菌操作取25 g样品,放入装有225 mL稀释剂的灭菌均质杯内,于8000 r/min均质1～2min,制成1:10样品匀液(也可用灭菌乳钵研磨的方法代替).
稀释样品匀液根据对样品污染情况的估计,用稀释剂将样品匀液制成一系列十倍递增的样品稀释液,如10**-2、10**-3、10**-4…….从制备样品匀液至稀释完毕,全过程不得超过15min.
附：这是一种9管MPN法测定方法.
LST和EC初步筛选：
对每个样品,选择适宜的三个连续稀释度的样品稀释液.每个稀释度接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白(月示)(LST)肉汤,每管接种1mL.将接种管置于36±1℃培养48±2h.
观察试管的产气情况：检查倒管内是否有气泡产生,用直径为3mm的接种环将所有48±2h内产气的LST肉汤管培养物移种于EC肉汤管中.将所有接种的EC肉汤管在30min内放入带盖44.5±0.5℃水浴箱内,培养48±2h.
EMB平板：
取其产气管的培养物划线接种于伊红美蓝(EMB)平板,36±1℃培养24±2h.
检查平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落.
如有典型菌落,则从每个平板上至少挑取2个典型菌落；如无典型菌落,则从每个平板上至少挑取2个可疑菌落.用接种针接触菌落中心部位,移种到营养琼脂斜面上,36±1℃培养18～24h.
平板划线示例
EMB平板原理及照片
生化试验：
将斜面培养物移种到下列培养基中进行生化试验.
1 色氨酸肉汤：在36±1℃培养24±2h后,加Kovacs氏试剂0.0.3mL,上层出现红色为靛基质阳性反应.
2 MR-VP培养基：在36±1℃培养48±2h.以无菌操作移取培养物1 mL至13mm×100mm试管中,加5％α-萘酚乙醇溶液0.6mL,40％氢氧化钾溶液0.2mL和少许肌酸结晶,振摇试管后静置2h,如出现伊红色,为VP试验阳性.
将MR-VP培养物的剩余部分再培养48h滴加5 滴甲基红溶液.如培养物变红色,为甲基红试验阳性,若变黄色则为阴性反应.
3 Koser氏枸椽酸盐肉汤：于36±1℃培养96h记录有无生长.
4 LST肉汤：于36±1℃培养48±2h,观察试管中是否产气.
5 革兰氏染色：取18h营养琼脂斜面培养物作革兰氏染色.大肠杆菌为革兰氏阴性.
大肠杆菌与非大肠杆菌生化鉴别如下：
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靛 基 质┃ MR ┃ VP ┃ 枸椽酸盐 ┃ 鉴定(型别)
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＋ ┃ ＋ ┃ － ┃ － ┃典型大肠杆菌
－ ┃ ＋ ┃ － ┃ － ┃非典型大肠杆菌
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＋ ┃ ＋ ┃ － ┃ ＋ ┃典型中间型
－ ┃ ＋ ┃ － ┃ ＋ ┃非典型中间型
━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━━
－ ┃ － ┃ ＋ ┃ ＋ ┃典型产气肠杆菌
＋ ┃ － ┃ ＋ ┃ ＋ ┃非典型产气肠杆菌
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如出现上表以外的生化反应类型,表明培养物可能不纯,应重新划线分离,必要时做
重复试验.
结果报告：
大肠杆菌为革兰氏阴性无芽孢杆菌,发酵乳糖产酸产气,IMViC试验为＋＋
－－或－＋－－,再根据LST肉汤阳性管数查MPN表,报告每克(毫升)样品中大肠杆菌MPN
值.

刘小拓讲的基本是药典上的专业检测方法。如果你有各种菌体的显微照片及扎实的显微检测经验可用计数板进行显微计数，但请注意计数所的值是活菌体与死菌体的总和，该法仅适用快速检测。

大肠杆菌检验（包括(一)检验方法；(二)培养基 ）
(一)检验方法
1．乳糖发酵试验。以无菌操作采取样品，采取量及稀释倍数，依据国家或当地卫生标准要求及样品污染情况而定。将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在l m J以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，lm1及1mI以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管，置36±l℃温箱内，培养24±2小时，如所有乳糖胆盐发酵管都不...

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大肠杆菌检验（包括(一)检验方法；(二)培养基 ）
(一)检验方法
1．乳糖发酵试验。以无菌操作采取样品，采取量及稀释倍数，依据国家或当地卫生标准要求及样品污染情况而定。将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在l m J以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，lm1及1mI以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管，置36±l℃温箱内，培养24±2小时，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性；如有产气者，则按下列程序进行。
2．分离培养。将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置36±l℃温箱内，培养18～24小时，然后取出，观察菌落形态，并作革兰氏染色和证实试验。
3．证实试验。在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落l～2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置36±1℃ 温箱内培养24±2小时，观察产气情况。凡乳糖管产气，革
兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。
4．报告。根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每l 00ml(g)大肠菌群的最可能数。
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(二)培养基
①乳糖胆盐发酵培基
成分：蛋白胨：20g
猪胆盐(或牛，羊胆盐)：5g
乳糖:10g
0．04％溴甲酚紫水溶液: 25m1
蒸馏水: 1 000m1
制法：将蛋白胨、胆盐及乳糖溶于水中，校正pH，加入指示剂，分装每管l 0ml，并放入一个小倒管，高压灭菌115℃15分钟。
附注：双料乳糖胆盐发酵培基除蒸馏水外，其他成分加倍。
用途：乳糖发酵试验用。
原理：细菌分解糖类是依靠细菌细胞所产生的各种酶类的作用，细菌产生的分解糖类的酶，随细菌种类不同而异，可以此来鉴别细菌。
乳糖是双糖，细菌分解双糖的酶大多是胞外酶。乳糖被乳糖酶水解成葡萄糖和半乳糖，葡萄糖可直接被细菌利用，而半乳糖则需在细胞内转化为葡萄糖后再被利用。
糖发酵试验主要是测定细菌分解糖类以后所产生的酸，以培基pH降低(指示剂变色)作为观察结果的指标。
大肠杆菌等细菌在酸性环境中，由于甲酸脱氢酶的作用，可使甲酸分解成CO2和H2，在培基中产生大量气体，进入倒管中，以便观察。
注：常用于供发酵试验的各种糖类、醇类和糖苷类(见表3-1)
②伊红美蓝琼脂培基
成分：蛋白胨 10g
乳糖 10g
磷酸氢二钾 2g
琼脂 17g
2％伊红Y溶液 20ml
0．65％美蓝溶液 10ml
蒸馏水 1000ml
pH7.1
制法：将蛋l白胨、磷酸盐和琼脂溶解于蒸馏水中，校正pH，分装于烧瓶内，高压灭菌121℃15分钟备用。临用时加入乳糖，并加热溶化琼脂，冷至50一55℃，加入伊红和美蓝溶液，摇匀，倾注平板。
原理：大肠菌群细菌发酵乳糖产酸，使伊红与美蓝结合而成黑色化合物，故菌落呈黑紫色，有时还可产生金属光泽。黑色程度与光泽产生情况与伊红、美蓝二者比倒有关。不发酵乳糖的细菌(如沙门氏菌、志贺氏菌)则为无色菌落。
③乳糖发酵培基
成分：蛋白胨 20g
乳糖 10g
O．04％溴甲酚紫水溶液 25ml
蒸馏水 1000ml
pH7．4
制法：将蛋白胨及乳糖溶于水中，校正pH，加入指示剂，按检验要求分装30ml、10ml或3ml，并放入一个小倒管，高压灭菌115℃15分钟。
附注： ’
(1)双料乳糖发酵管除蒸馏水外，其他成分加倍。
(2)30ml和10ml乳糖发酵管专供酱油及酱类检验用．3ml乳糖发酵管供大肠菌群
证实试验用。
4．蛋白胨水
成分：蛋白胨(或胰蛋白胨) 20g
氯化钠 5g
蒸馏水 1 000ml pH7．4

收起

大肠菌群coliforms
一群在36℃ 条件下培养48h 能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。该菌群主要来源于人畜粪便，作为粪便污染指标评价食品的卫生状况，推断食品中肠道致病菌污染的可能。
2.2
最可能数most probable number ; MPN
基于泊松分布的一种间接计数方法。
3 设备和材料
除微生物实验...

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大肠菌群coliforms
一群在36℃ 条件下培养48h 能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。该菌群主要来源于人畜粪便，作为粪便污染指标评价食品的卫生状况，推断食品中肠道致病菌污染的可能。
2.2
最可能数most probable number ; MPN
基于泊松分布的一种间接计数方法。
3 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
3.1 恒温培养箱：36℃±1℃ 。
3.2 冰箱：2℃-5℃ 。
3.3 恒温水浴箱：46℃±1℃ 。
3.4 天平：感量0.1g
3.5 均质器。
3.6 振荡器。
3.7 无菌吸管：1mL（具0.01ml刻度）、10ml（具0.1ml刻度）或微量移液器及吸头。
3.8 无菌锥形瓶：容量500ml。
3.9 无菌培养皿：直径90 mm 。
3.10 pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。
3.11 菌落计数器或PetrifilmTM自动判读仪。
4 培养基和试剂
4.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（lauryl sulfat .tryptose , LST ）肉汤：见第A.1 章。
4.2 煌绿乳糖胆盐（brilliant grecn lactose bile , BGLB ）肉汤：见第A.2 章。
4.3 结晶紫中性红胆盐琼脂（violet red bile agar , VRBA )
4.4 磷酸盐缓冲液
4.5 无菌生理盐水：称取8.5g 氯化钠溶于1000ml蒸馏水中，121℃ 高压灭菌15 min 。
4.6 1mol/L氢氧化钠（NaOH ) ：称取40g 氢氧化钠溶于1000ml蒸馏水中。
4.7 1mol/L 盐酸（HCI ) ：移取浓盐酸90ml，用蒸馏水稀释至1000ml。
4.8 Petrifiltm大肠菌群检验测试片和压板。
第一法大肠菌群MPN 计数
操作步骤
6.1、样品的稀释
6.1.1、 固体和半固体样品：称取25g 样品，放人盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8 00or/min-10 000r/min 均质1 min-2 min ，或放人盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min-2 min ，制成1:10 的样品匀液。
6.1.2、 液体样品：以无菌吸管吸取25ml样品，置盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分棍匀，制成1:10 的样品匀液。
6.1.3、 样品匀液的pH 值应在6.5-7.5 之间，必要时分别用1mol/L 氢氧化钠（NaOH ）或1 mol/L 盐酸（HCI ）调节。
6.1.4、 用1ml无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1ml，沿管壁缓缓注人9ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1 支1ml无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。
6.1.5、 根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成10 倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1 次，换用1 支1ml无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15 min 。
6.2、 初发酵试验
每个样品，选择3 个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3 管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1ml（如接种量超过1ml，则用双料LST肉汤）, 36℃±1℃ 培养24h±Zh ，观察倒管内是否有气泡产生，如未产气则继续培养至48h±2h 。记录在24h 和48h 内产气的LST 肉汤管数。未产气者为大肠菌群阴性，产气者则进行复发酵试验。
6.3、 复发酵试验
用接种环从所有48h±2h 内发酵产气的LST 肉汤管中分别取培养物l环，移种于煌绿乳糖胆盐( BGLB）肉汤管中，36℃±1℃ 培养48h±2h ，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。
6.4、 大肠菌群最可能数（MPN ）的报告
根据大肠菌群阳性管数，检索MPN 表（见附录B ) ，报告每克（或毫升）样品中大肠菌群的MPN 值。
第二法大肠菌群平板计数
8、 操作步骤
8.1、 样品的稀释
按6.1 进行。
8.2、 平板计数
8.2.1、 选取2 个～3 个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种两个无菌平皿，每皿1ml。同时分别取1ml生理盐水加人两个无菌平皿作空白对照。
8.2.2、 及时将15 mL-20ml冷至46℃ 的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA ）约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3 mL-4mlVRBA 覆盖平板表层。翻转平板，置于36℃±l℃ 培养18h-24h 。
8.3、 平板菌落数的选择
选取菌落数在30-150 之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5 mm 或更大。
8.4、 证实试验
从VRBA 平板上挑取10 个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB 肉汤管内，36℃±1℃ 培养24h-48h ，观察产气情况。凡BGLB 肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。
8.5 、大肠菌群平板计数的报告
经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以8.3 中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每克（或毫升）样品中大肠菌群数。
第三法大肠菌群PetrifilmTM 测试片法
10、 操作步骤 10.1 样品的稀释
按6.1 进行。
10.2、 测定
10.2.1、 样品接种及培养
将待检样品选取2 个-3 个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种两张测试片。将PetrifilmTM 大肠菌群测试片置于平坦实验台面，揭开上层膜，用吸管吸取1ml样液垂直滴加在测试片的中央，将上层膜缓慢盖下，避免气泡产生和上层膜直接落下。把压板（平面底朝下）放置在上层膜中央，轻轻地压下，使样液均匀覆盖于圆形的培养面积上，切勿扭转压板。拿起压板，静置至少1 min 以使培养基凝固。将测试片的透明面朝上置于培养箱内，堆叠片数不超过20片，36℃±1℃ 培养24h±2h 。
10.2.2、 判读
培养24h±Zh 后应立即计数，可目测或用标准菌落计数器、放大镜或PetrifilmTM 自动判读仪来计数。红色有气泡的菌落确认为大肠菌群。圆形培养区边缘上及边缘以外的菌落不作计数。当培养区域出现大量气泡，大量不明显小菌落或培养区呈暗红色三种情况，表明大肠菌群的浓度较高，需要进一步稀释样品以获得更准确的读数。
10.3、 大肠菌群测试片计数的报告
选取菌落数在15-150 之间的测试片，计数其红色有气泡的菌落数，两个测试片的平均菌落数乘以稀释倍数即为每克（或毫升）样品中的大肠菌群菌落形成单位（CFU ）数。如果所有稀释度测试片上的菌落数都小于15 ，则计数稀释度最低的测试片上的平均菌落数乘以稀释倍数报告；如果所有稀释度的测试片上均无菌落生长，则以小于1 乘以最低稀释倍数报告；如果最高稀释度的菌落数大于150 ，计数最高稀释度的测试片上的平均菌落数乘以稀释倍数报告。计数菌落数大于150 的测试片时，可计数一个或两个具有代表性的方格内的菌落数，换算成单个方格内的菌落数后乘以20 即为测试片上估算的菌落数（圆形生长面积为20cm2 , ）。报告单位以CFU/g （或CFU/mL ）表示。
具体的你可以查一下GB/T4789.03-2008或这是GB/T4789.38-2008

收起

这个实验我做过！我帮你找找我当时的试验报告看看！不过，我们当时做的时候很粗虐！因为饮料中基本上是没有大肠杆菌的,所以当时没有看到大肠杆菌菌落就没做了~！希望对你有用~