怎样用实验证明DNA是从5'向3'复制

怎样用实验证明DNA是从5'向3'复制
怎样用实验证明DNA是从5'向3'复制

怎样用实验证明DNA是从5'向3'复制
嗯,不能证明,因为已经证明了不是.^ ^
DNA复制是双向的
许多关于DNA的早期研究都是以细菌或噬菌体等简单生物进行的,因为细菌的个体是缺乏细胞核的单细胞,生长容易,因而易于开展象DNA复制等分子机制的研究.人们期望通过对细菌的研究所发现的机制能应用到更复杂的生物体,结果,当时细菌被广泛地用于DNA复制的研究,其中大肠杆菌被首先用来确立DNA是怎样开始复制的.
1963年J.Cairns用含有3H-胸腺嘧啶核苷的培养基（热培养基）培养大肠杆菌,DNA复制时,放射性同位素就掺入到DNA中.在热培养基中经过不同时间的培养使DNA经历不同次数的复制后,从细菌细胞中抽取DNA,漂浮到膜上,经放射自显影后,在电子显微镜下进行观察.DNA在热培养基中复制一次后,一条DNA链是旧的,没有放射性,一条DNA链是新合成的,有放射性,所以在电子显微镜下是一个由小点构成的圆圈(图5-10A).当环形DNA双链在热培养基中进入第二次复制周期,可以看到一个眼球状的结构,两侧各有一个Y形复制叉,放射自显影图中三个区段的粒子密度不同,中间的弧形区段粒子密度最高,它代表两条新链,分别是在第一和第二复制周期中合成的,外圈的粒子密度较小,表示它是由一条非放射性的旧链和一条放射性新链组成(图5-10B).
E.coli DNA复制时,眼球的大小可以不同,但每一个分子的眼球数仅限于一个,可见DNA的复制是从一点开始的.以后由很多体系用不同的实验手段获得的结果都证明,原核生物的复制是在DNA分子的特定位点开始的,这一位点叫复制起点,常用ori表示.原核生物的染色体只有一个复制起点,复制从起点开始,进行到终点结束.现在我们知道E.coli的复制起点是由一段叫oriC的DNA序列所控制的,这段序列长约250bp,其中有一个9bp的共同序列5'-TTAT(C/A)CA(CA)A重复4次.E.coli、噬菌体以及质粒DNA都是独立复制的.这种独立复制的单位叫复制子(replicon),所谓复制子是指基因组中能独立进行复制的单位.原核生物的染色体是单复制子的.
DNA的复制从一点开始以后,复制是单向还是双向进行的呢?仅从Cairns的实验我们无法知道答案.如果是单向复制,眼球应该是往一个方向扩展的,如果是双向复制,眼球应该是同时向两端扩展.1972年,D.Prescotl和P Kuempel进行了下列实验：将E.coli生长在含有3H-胸腺嘧啶核苷的培养基上使同位素渗入DNA上,在DNA上有低水平的3H（氚）存在,有刚好足够的3H使X-胶片曝光后可见到复制起点处的DNA痕迹（轻标记）,然后,将这些细胞短时间曝露在一个很高浓度的3H-胸腺嘧啶核苷中（脉冲标记,重标记）,将裂解的细胞曝露在感光乳胶后,Prescott和Kuempel发现在伸长的染色体的两端有二条短的高密度银粒的痕迹(图5-11),对这一结果的唯一解释是DNA正在从原点出发同时向两个方向复制.这就证明了在E.coli中DNA的复制是双向的.
高等生物的DNA是一个很大的分子,长度约为E.coli DNA的数百倍,对真核生物DNA复制的研究表明,复制也是从特定的起点开始双向进行的.然而与原核生物不同的是,在真核生物的DNA分子内有多个起始点(图5-12),也就是说高等生物的染色体是多复制子的.
大多数生物体内DNA的复制都以双向等速方式进行,但也有例外的情况.例如在枯草杆菌中,复制是从起点开始双向进行的,但两个复制叉的移动是不对称的,在一个方向上移动染色体1/5的距离,然后停下来等另一个方向复制4/5的距离.质粒ColEI的复制完全是单向进行的.在大多数生物中,DNA分子的两条链是同时复制的,但也有在一定时期内DNA只复制一条链的情况,如线粒体的D环复制和一些噬菌体的滚环复制方式.
在整体的复制速度方面,虽然细菌的每个复制叉的移动速度要快一些,但染色体全体的复制速度还是高等生物快,因为它有多个复制起点.另外,染色体复制的速度随细胞种类及生理状态而异,但这不是由于复制叉的移动速率不同所造成的,是由复制起始点的多少及复制从哪个起始点开始决定的,在一些生长缓慢的细胞中,每一染色体上复制起点的数目大大减少.