在含卡那的培养板和培养基中都长,菌液PCR也有,就是提不出来质粒用pET30a构建原核表达载体,连接产物转化,长了满板,条单克隆到含卡那的液体培养基中,长了,菌液PCR有条带,但提质粒提不出来
来源:学生作业帮助网 编辑:作业帮 时间:2024/07/13 15:34:39
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在含卡那的培养板和培养基中都长,菌液PCR也有,就是提不出来质粒用pET30a构建原核表达载体,连接产物转化,长了满板,条单克隆到含卡那的液体培养基中,长了,菌液PCR有条带,但提质粒提不出来
在含卡那的培养板和培养基中都长,菌液PCR也有,就是提不出来质粒
用pET
30a构建原核表达载体,连接产物转化,长了满板,条单克隆到含卡那的液体培养基中,长了,菌液PCR有条带,但提质粒提不出来
而且,又用能扩出来的菌液划板,再挑单克隆,再扩菌液PCR,就又扩不出来了,我怀疑是切胶回收产物不纯,有原质粒污染,但为什么什么质粒都提不出来。直接诱导表达,会不会太着急了,在没有确定真的连进去目的基因的情况下
在含卡那的培养板和培养基中都长,菌液PCR也有,就是提不出来质粒用pET30a构建原核表达载体,连接产物转化,长了满板,条单克隆到含卡那的液体培养基中,长了,菌液PCR有条带,但提质粒提不出来
pET 30a 在菌内是偏保守的质粒,拷贝数比较低,建议你做大提质粒,否则带很暗,看不清.
还有,既然你已经菌液PCR有条带了,为什么不诱导表达做western来验证下有没有表达产物?
菌液pcr明显假阳性么,这种情况遇到的太多了。当然不能直接诱导表达,建议你在质粒上设计forward primer,连接片段上设计reverse primer,这样就可以排除假阳性了。重做一次克隆也快,你小心点,重头来遍就可以了,不用急,载体回收好,排除质粒污染,少酶切点,载体一点点就够了,时间长点,NEB的3h,一般的酶酶切过夜。...
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菌液pcr明显假阳性么,这种情况遇到的太多了。当然不能直接诱导表达,建议你在质粒上设计forward primer,连接片段上设计reverse primer,这样就可以排除假阳性了。重做一次克隆也快,你小心点,重头来遍就可以了,不用急,载体回收好,排除质粒污染,少酶切点,载体一点点就够了,时间长点,NEB的3h,一般的酶酶切过夜。
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