作业帮求DGGE技术原理和操作步骤
来源：学生作业帮助网 编辑：作业帮 时间：2024/11/24 06:41:01
求DGGE技术原理和操作步骤
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1、实验原理
变性梯度凝胶电泳（DGGE）是一种根据DNA片段的熔解性质而使之分离的凝胶系统.核酸的双螺旋结构在一定条件下可以解链,称之为变性.核酸50%发生变性时的温度称为熔解温度（Tm）.Tm值主要取决于DNA分子中GC含量的多少.DGGE将凝胶设置在双重变性条件下：温度50~60 ℃,变性剂0~100%.当一双链DNA片段通过一变性剂浓度呈梯度增加的凝胶时,此片段迁移至某一点变性剂浓度恰好相当于此段DNA的低熔点区的Tm值,此区便开始熔解,而高熔点区仍为双链.这种局部解链的DNA分子迁移率发生改变,达到分离的效果.Tm的改变依赖于DNA序列,即使一个碱基的替代就可引起Tm值的升高和降低.因此,DGGE可以检测DNA分子中的任何一种单碱基的替代、移码突变以及少于10个碱基的缺失突变.
为了提高DGGE的突变检出率,可以人为地加入一个高熔点区——GC夹.GC夹（GC clamp）就是在一侧引物的5′端加上一个30~40bp的GC结构,这样在PCR产物的一侧可产生一个高熔点区,使相应的感兴趣的序列处于低熔点区而便于分析.因此,DGGE的突变检出率可提高到接近于100%.
作为一种突变检测技术,DGGE具有如下的优点：（1）突变检出率高.DGGE的突变检出率为99%以上.（2）检测片段长度可达1kb,尤其适用于100~500bp的片段.（3）非同位素性.DGGE不需同位素掺入,可避免同位素污染及对人体造成的伤害.（4）操作简便、快速.DGGE一般在24小时内即可获得结果.（5）重复性好.但是,该方法需要特殊的仪器,而且合成带GC夹的引物也比较昂贵.
2步骤
1．PCR反应（同前）
其中,上游引物加40bp [GC] Clamp.
2．PCR产物经琼脂糖凝胶电泳确认.
3．垂直变性梯度凝胶电泳
变性梯度递增的方向与电泳方向垂直.所使用的胶为4%-10%聚丙烯酰胺凝胶,变性浓度为0～100%.其中,含7 M尿素和40%去离子甲酰胺的胶为100%变性,不含尿素和去离子甲酰胺的胶为0%变性.垂直变性梯度凝胶电泳主要是检测引物的最适解链条件（即变性浓度）.
PCR产物加上样缓冲液后上样,300～400µl/孔
4．平行变性梯度凝胶电泳
变性梯度递增的方向与电泳方向平行.根据垂直变性梯度凝胶电泳检测的解链区域的变性浓度,制备相应变性浓度的平行变性梯度凝胶,检测各标本是否存在突变.
PCR产物加上样缓冲液后,25μl～30μl/孔,电压80-120V,温度60℃,时间31～16小时.
5．染色5分钟,凝胶成像仪分析结果.