什么是realtime PCR,什么是q-pcr,所用反应物质与普通PCR有何不同稍微详细点,最好附加点做的注意事项.查查百度百科什么的,我也会.另外RealTime-q-pcr 是不是就是q-pcr?

什么是realtime PCR,什么是q-pcr,所用反应物质与普通PCR有何不同稍微详细点,最好附加点做的注意事项.查查百度百科什么的,我也会.另外RealTime-q-pcr 是不是就是q-pcr?
什么是realtime PCR,什么是q-pcr,所用反应物质与普通PCR有何不同
稍微详细点,最好附加点做的注意事项.查查百度百科什么的,我也会.另外RealTime-q-pcr 是不是就是q-pcr?

什么是realtime PCR,什么是q-pcr,所用反应物质与普通PCR有何不同稍微详细点,最好附加点做的注意事项.查查百度百科什么的,我也会.另外RealTime-q-pcr 是不是就是q-pcr?
实时定量PCR (real-time quantitative PCR),简称real-time PCR,q-pcr,q-RT-PCR等等,都是一个意思.普通PCR结果反映的其实是PCR的结果,而当PCR经过多伦循环到平台期后,很难反映原来模板的浓度；而实时定量PCR 反映的是PCR的过程,它起飞时间的Ct值可以精确反映模板的浓度.定义,操作,原理什么的我就不说了,自己查百度百科和文库,我就从实战给你点注意事项吧.
1 选好内参基因,特别是同一物种不同组织中某基因的表达情况,一定要别人报道过在你检测的组织中变化不大,如果你只是拿一个别的物种中的同源基因,别人肯定会argue你的,如果有可能可以双内参.
2 最好有标准曲线,标曲反应扩增效率,这样比较准确点,不然只能用2 delta delta t法了,有些杂志扣的话,不太好解释.标曲可以用cDNA来制备,还可以直接有已知模板来制（可以搜一下网上的标曲制备方法）
3 结果先看融解曲线,如果只有特异的单一融解峰,再去分析数据,不然没有意义.

由于PCR敏感性高，扩增产物总量变异系数大，定量不准确。90年代末期出现了Q-PCR， 利用荧光检测PCR仪绘制DNA扩增过程中的累积速率动态变化图，基本消除在测定终端产物丰度时变异系数较大的问题。混合在PCR反应液中的荧光探针只有与双链DNA结合后，才能够被激发出荧光。随着新合成DNA片段的增加，由于结合到DNA上的荧光探针增加，被激发产生的荧光相应增加。
为确保荧光检测的确实是...

全部展开

由于PCR敏感性高，扩增产物总量变异系数大，定量不准确。90年代末期出现了Q-PCR， 利用荧光检测PCR仪绘制DNA扩增过程中的累积速率动态变化图，基本消除在测定终端产物丰度时变异系数较大的问题。混合在PCR反应液中的荧光探针只有与双链DNA结合后，才能够被激发出荧光。随着新合成DNA片段的增加，由于结合到DNA上的荧光探针增加，被激发产生的荧光相应增加。
为确保荧光检测的确实是靶DNA，又设计了仅能与目的DNA特异结合的荧光探针。TaqMan探针是一段与靶DNA序列中间部位结合的单链DNA，长50bp-150bp，该DNA的5’和3’端带有短波长和长波长两个不同荧光基团，由于彼此距离靠近，在荧光共振能量转移（FRET）作用下发生荧光淬灭，因而检测不到荧光。随着PCR反应的进行，TaqMan 探针结合到目的DNA序列上，并且会被具有外切酶活性的Taq DNA聚合酶逐个切除而降解。切下来的荧光基团解除了荧光淬灭的束缚，会在激发光下发出荧光，因此，产生的荧光强度直接反映了所扩增靶DNA的总量。
实时定量PCR的参数:Ct值
Ct值是产物荧光强度首次超过设定阈值时，PCR反应所需的循环数。实时定量PCR可定量比较各样本之间待检测靶DNA多少，显示的是各样本之间的相对含量。利用标准曲线，可以确定样品中待检测靶DNA的绝对含量。
以上是我们上课课件上的内容。反应物质的话，就是多加了荧光染料。Real Time q-PCR就是实时定量PCR。

收起

所谓real-time Q-PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化,通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。...

全部展开

所谓real-time Q-PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化,通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。

收起