酵母双杂交的具体过程是什么?（中文）

酵母双杂交的具体过程是什么?（中文）
酵母双杂交的具体过程是什么?（中文）

酵母双杂交的具体过程是什么?（中文）
菌株与质粒AH109酵母菌株(MATa,trp1．
901,leu2—3,112,ura3-52,his3-200,gal4A,gal8O~X,
LYS2：：G地1U^s-GALlT^T^-HIS3,G U^s—GAI2T^T^-
ADE2,URA3：：h吐1U^s．h吐1T^T^．1acZ),YM187酵母
菌株(NATQ,um3-52,his3-200,ade2—101,trpl-901,
leu2-3,112,g △,met,O△,URA3：：GAL1U^s-
GAL1T^T^一laeZ,NE!,1)．I~BKT7-p53是编码鼠p53蛋
白(a．a．72—390)和GAL4 DNA BD(a．a．1—147)融合
蛋白的阳性对照质粒.pcArrr7．T是编码SV40大T
抗原(a．a．87—7O8)和GAL4 DNA．BD(a．a．1—147)融
合蛋白的阳性对照质粒,上述菌株与质粒均购自
CLONTECH公司.JIVl109大肠杆菌菌株购自promega
公司.
1．2 试剂鲑鱼精担体DNA,酵母培养用的YPD
Medium SD Minimal medium 一 DO Supplement 一Leu
DO Supplement、一Leu／一Trp DO Supplement、一Leu／Trp／His
DO Supplement、一Ade／一His／一L~aTrp 130 Supplement等
均购自CLONTECH.硫酸腺嘌呤(Adenine hemisul.
fate)购自Gibco.PEG 3250购自Sigma.DMSO购自
AMRESCO.硝酸纤维素膜购自Phamacia.X-Gal购
自BBI.QIAprep Miniprep Kit购自QIAGEN公司,其
它常规分子生物学试剂购自北京华美生物公司.
1．3 pGBKT7．ps3和t~alrr7．T质粒的制备用2
mL LB液体培养基扩增pGBKT7一p53和pGADT7一T质
粒.分别用小规模碱裂解法【7 (AIK法)和QtarREP
Miniprep Kit试剂盒(QIAGEN法)提取质粒.紫外分
光光度法测0D260／280,并计算质粒DNA含量.
1．4 酵母双杂交共转化实验按酵母操作手册
建议的方法进行转化,取不同量的上述两种方法提
取的pGBKT7—053和pGADT7．T质粒共转化到AH109
酵母菌株中,将转化好的细胞按照1：10、1：100、1：
10003种不同浓度稀释,然后取100 铺于SD／
Trp／一Leu平板上,待长出克隆后计算生长克隆数目
(cfu).计算共转化效率：转化效率cfu／／．tg DNA=cfu
×悬浮细胞体积( )×稀释倍数／[铺板体积( )×
DAN‘](*这里的DNA的量指的是所用一份的
质粒量而非全部质粒总量).
1．5 酵母双杂交顺序转化实验取不同量的上述
两种方法提取的pGBKT7—053转化于AH109酵母菌
株,用SD／ TW缺陷培养基筛选得到AH109[pGBKT7—
53],挑取新鲜的直径为2—3 iran的AH109[pGBKT7一
p53]酵母单克隆4—8个,接种于1 ml SD／一Trp缺陷
液体培养基中,旋涡振荡1 mira,彻底打散菌团.将1
IIll菌液转移到5O IIll的sD液体缺陷培养基中.将
pGADT7一T转化于AH109[pGBKTT-53],其余方法同
酵母操作手册,将转化好的细胞按照1：10、1：100、1：
1000三种不同浓度稀释,然后取100 铺于SD／一
Trp／．Leu平板上,待长出克隆后计算生长克隆数目
(cfu).按上述公式计算转化效率.
1．6 酵母双杂交交配实验 将pGBKT~．p53和
pGADTrT质粒分别转化于酵母菌株AH109和
YM187中,待在相应SD缺陷培养基平板上生长出
克隆后,分别各挑取一个2—3 nl／n酵母单克隆共放
置于一个含有0．5 ml YPDA液体培养基的1O IIll离
心管中,涡流震荡1 min,彻底打散菌团,3ocI=、200rpm过夜培养(20—24 h).100 交配培养物铺于
SD／一 一Leu培养基平板,200 交配培养物铺于
SD／一His／一I~u／Tw(TDO )培养基平板.检测二倍体数
目：将交配产物按照1：10、1：100、1：1000三种不同浓
度稀释,然后取100 铺于SD／一Trp／．Leu平板.待长
出克隆后计数cfu.计算二倍体细胞数目：cfu×悬
浮细胞体积(ta)×稀释倍数／铺板体积(ta).
1．7 窖a1分析实验
1．7．1 8一半乳糖苷酶的定性分析 检测AH109
[pGBKT7—053+pGADT7一T]的8一半乳糖苷酶活性,挑
酵母克隆(新鲜直径为2—3 mm)划双斜线于平铺在
相应培养基平板上的灭菌的硝酸纤维素膜上,3ocI=
倒置培养24小时.将膜于液氮中冷冻,冷冻时间分
别为10 s、30 s、1 rain、2 rain,30cI=放置10 mill,置于浸
没于Z bufer／X．gal(100 ml Z bufer、0．27 ml f≥I巯基乙
醇、1．67 ml 20 mg／m~的X—ga1)溶液的滤纸上(z bufedX．
gal溶液以刚刚浸湿滤纸为佳),放置于3OcI=下
进行观察,15 rain记录一次,以后可每隔1 h记录一
次.观察不同条件下菌落的颜色变化,划线的酵母
菌落颜色在8 h内显色变蓝的即为阳性结果.同时
没定液氮冷冻时间为1 min,比较处于不同显色温度
(25℃、30℃、37℃)下f；-半乳糖苷酶的活性.
1．7．2 8一半乳糖苷酶的定量分析定量分析AH109
[pGBKT7—053+pGADT7一T]的8一半乳糖苷酶活性,同
时以AH109[pCL1]为阳性对照,AH109[pGBKT7—053
+pG~rr7一T]和AH109[pGBKT~+pGADT~一T]为空载
体对照,AH109为阴性对照.AH109[pCL1]的稀释
倍数为3,其余的稀释倍数为1.具体步骤参照酵母
操作手册.计算p半乳糖苷酶的单位：1000×OD∞／
(t×V×ODao),其中t为反应时间,V=0．1 ml×稀
释倍数.