考马斯亮蓝法测定牛血清蛋白的标准曲线!运用考马斯亮蓝法测定的牛血清清蛋白的标准曲线~~~要标准曲线或数据均可~~~谢谢~~~

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考马斯亮蓝法测定牛血清蛋白的标准曲线!
运用考马斯亮蓝法测定的牛血清清蛋白的标准曲线~~~
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标准曲线制作—考马斯亮蓝法测蛋白质含量
一、 标准曲线
一般用分光光度法测物质的含量,先要制作标准曲线,然后根据标准曲线查出所测物质的含量.因此,制作标准曲线是生物检测分析的一项基本技术.
二、 蛋白质含量测定方法
1、 凯氏定氮法
2、 双缩脲法
3、 Folin-酚试剂法
4、 紫外吸收法
5、 考马斯亮蓝法
三、 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—标准曲线制作
（一）、试剂：
1、 考马斯亮蓝试剂：
考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇,加入100ml 85% H3PO4,雍蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤.最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G—250,4.7%（W/V）乙醇,8.5%（W/V）H3PO4.
2、 标准蛋白质溶液：
纯的牛血清血蛋白,预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,根据其纯度同0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液.
（二）、器材：
1、722S型分光光度计使用及原理（）.
2、移液管使用（）.
（三）、标准曲线制作：
试管编号 0 1 2 3 4 5 6
100ug/ml标准蛋白（ml） 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
0.15mol/L NaCl （ml） 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4
考马斯亮蓝试剂 （ml） 5 5 5 5 5 5 5
摇匀,1h内以1号管为空白对照,在595nm处比色
A595nm
1、
2、以A595nm为纵坐标,标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug）,在坐标轴上绘制标准曲线.
1）、利用标准曲线查出回归方程.
2）、用公式计算回归方程.
3）、或用origin作图 ,测出回归线性方程.即A595nm=a×X( )+6
一般相关系数应过0.999以上,至少2个9以上.
4）、绘图时近两使点在一条直线上,在直线上的点应该在直线两侧.
（四）、蛋白质含量的测定：
样品即所测蛋白质含量样品（含量应处理在所测范围内）,依照操作步骤1操作,测出样品的A595nm,然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量.
一般被测样品的A595nm值在0.1—0.05之间,所以上述样品如果A595nm值太大,可以稀释后再测A595nm值,然后再计算.
（五）、注意事项：
1、 玻璃仪器要洗涤干净.
2、 取量要准确.
3、 玻璃仪器要干燥,避免温度变化.
4、 对照：用被测物质以外的物质作空白对照.
药品的配制（磷酸缓冲液的配制）
一、药品的配制步骤
（一）、实验准备：
1、 准备所需的药品和玻璃仪器.
2、 洗涤.（怎样洗涤算干净?）
（二）、计算：
1、百分比浓度计算：
1)、G/V比
例如配1% NaCl,称1g NaCl溶于100ml 水.
2）、V/V比：
例如配75%乙醇100ml,75%×100%=100%×X, X=75ml.取75ml无水乙醇,加25ml蒸馏水.
乙醇：乙醚：丙酮=2：1：2配500ml,各取200 ml,100 ml,200 ml混合.
3）G/V比：用的较少,如计算灰分中某种元素如Fe的含量.
2、摩尔浓度计算：注：药品的分子量一般在标签中注明.
1）、0.1M或0.1mol/L NaCl配100ml.
M=质量/体积（L）称取NaCl0.1×0.1×40=0.4g 摩尔数=G（g）/摩尔质量
2）、0.1mMNaCl配100ml
mM=毫摩尔数/体积（L） 称取NaCl0.1×0.1×40=0.4g
毫摩尔数=G（mg）/摩尔质量
3）、0.1uNaCl配100ml
mM=微摩尔数/体积（L） 称取NaCl0.1×0.1×40=0.4mg
微摩尔数=G（ug）/摩尔质量 称取NaCl0.1×0.1×40=0.4ug
3、 混合溶液配制的计算：
如配3uMEDTA,2.25mM NBT以及60uM 溶液100ml,用50mM磷酸缓冲液配制.
注意：1、分别标定体积计算
2、分别配制再混合,但总体积不能 为100ml
（三）、标量：
1、 根据需要选择不同量程的天平根据要求去不同精度的测量器,如量筒或移液管.
2、 电子分析天平的使用.
（四）、溶
1、 根据药品配置要求选择溶剂.蒸馏水,双蒸水,无离子水等.
2、 只能用烧杯溶解.注意加入溶剂只能加入总体积的2/3左右,剩余溶剂洗涤烧杯三次左右,直到洗涤干净.
小常识：药品标签中一般标识有药品的溶解性能和分子式,可根据分子式和所学的常识判断药品的结构和性质特点（包括溶解性质）.
如酸碱两性物质的配制（AA、蛋白质、核苷酸等）如果溶解性能不好可以用稀酸或稀碱促进溶解,但pH应在被要求的范围内.
3、 加热促进溶解,但注意应在配制的范围内有的药品还需水溶加热较好.如:配0.1%的淀粉,水裕加热（温度在80-90.C）,过量会糊化.
（五）、定容：
1、 用容量瓶定容；
2、 用玻璃棒引流或用小漏斗；
3、 用溶剂加入到接近刻度,然后用滴管加入到刻度.要求刻度与液体凹面相切为止（眼睛可视）；
4、 上下窑洞容量瓶几次,混合均匀即可.(注意不再定容了,防止溶液漏掉.)
（六）、装入试剂瓶,贴上标签.
标签应注明以下内容：药品浓度、名称、配制人、配制日期等.
（七）、清理实验场所.
二、磷酸缓冲液的配制.
（一）、配制0.2mol/L即0.2M pH=6.8的磷酸缓冲液.用磷酸氢二钠—磷酸二氢钠做缓冲液.
选用药品：Na2HPO4•12H2O（碱）和NaH2PO4•12H2O（酸）配缓冲液100ml.书中说明.
（二）、计算 ：
1、 注：书中有注明配置的量.
2、 计算：Na2HPO4•12H2O称取71.64×0.1=7.164g
NaH2PO4•12H2O称取 31.21×0.1=3.121g
3、 含有不同结晶水的换算.
书中配1/15mol/L的缓冲液配1L,书中用Na2HPO4•2H2O需要11.87g/L但用Na2HPO4•12H2O需多少g?
11.87=（178/358）×X,X=23.87g.
（三）、分别配制缓冲液各100ml（根据需要确定配制的量）.
即：0.2M Na2HPO4•2H2O和NaH2PO4•2H2O100ml.
（四）、按书中的量配制取量再混合.
如：pH=6.8,分别去缓冲对49ml和51ml.
（五）、用pH试纸ceni索赔的缓冲液的pH值,检测配置是否准确.
（六）如配50mM pH =6.8的缓冲液100ml ,以你配制的母液稀释即可.
计算：50×0.1=0.2×1000×X （L）；X =0.025L；
取0.2M pH=7.2的缓冲液25ml,用蒸馏水定容至100ml即可.