考马斯亮蓝G-250测定可溶性蛋白质 用什么作参比? 谢谢!11

考马斯亮蓝G-250测定可溶性蛋白质 用什么作参比? 谢谢!11
考马斯亮蓝G-250测定可溶性蛋白质 用什么作参比? 谢谢!11

考马斯亮蓝G-250测定可溶性蛋白质 用什么作参比? 谢谢!11
可溶性蛋白质含量的测定
——考马斯亮蓝法
一、原理
考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种.考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色,最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色,蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收.其光吸收值与蛋白质含量成正比,因此可用于蛋白质的定量测定.蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡,完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定.该法是1976年Bradford建立,试剂配制简单,操作简便快捷,反应非常灵敏,灵敏度比Lowry法还高4倍,可测定微克级蛋白质含量,测定蛋白质浓度范围为0～1000μg／mL,是一种常用的微量蛋白质快速测定方法.
二、材料、主要仪器和试剂
1、实验材料：植物叶片.
2、主要仪器
（1）分析天平、台式天平；（2）刻度吸管；（3）具塞试管、试管架；（4）研钵；（5）离心机、离心管；（6）烧杯、量筒；（7）微量取样器；（8）分光光度计.
3、试剂
（1）牛血清白蛋白标准溶液的配制：准确称取100mg牛血清白蛋白,溶于100mL蒸馏水中,即为1000μg／mL的原液.
（2）考马斯亮蓝G-250蛋白试剂的配制：称取100mg考马斯亮蓝G-250,溶于50mL90％乙醇中,加入85％（W／V）的磷酸100mL,最后用蒸馏水定容到1000mL.此溶液在常温下可放置1个月.
（3）乙醇；
（4）磷酸（85％）.
四、操作步骤
1、标准曲线制作
（1）0~100μg／mL标准曲线的制作：取6支10mL干净的具塞试管,按表1取样.盖塞后,将各试管中溶液纵向倒转混合,放置2min后用1cm光经的比色杯在595nm波长下比色,记录各管测定的光密度OD595nm,并做标准曲线.
表1 低浓度标准曲线制作
管号 1 2 3 4 5 6
1000μg／mL标准蛋白液（mL） 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10
蒸馏水（mL） 1.00 0.98 0.96 0.94 0.92 0.90
考马斯亮蓝G-250试剂（mL） 5 5 5 5 5 5
蛋白质含量（μg） 0 20 40 60 80 100
OD595nm
（2）0~1000μg／mL标准曲线的制作：另取6支10mL具塞试管,按表2取样.其余步骤同（1）操作,做出蛋白质浓度为0~1000μg／mL的标准曲线.
表2 高浓度标准曲线制作
管号 7 8 9 10 11 12
1000μg／mL标准蛋白液（mL） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
蒸馏水（mL） 1.00 0.8 0.6 0.4 0.2 0
考马斯亮蓝G-250试剂（mL） 5 5 5 5 5 5
蛋白质含量（μg） 0 200 400 600 800 1000
OD595nm
2、样品提取液中蛋白质浓度的测定
（1）待测样品制备：称取样品2g放入研钵中,加2mL蒸馏水研磨成匀浆,转移到离心管中,再用6mL蒸馏水分次洗涤研钵,洗涤液收集于同一离心管中,放置0.1h以充分提取,然后在4000r/min离心20min,弃去沉淀,上清液转入10mL容量瓶,并以蒸馏水定容至刻度,即得待测样品提取液.
（2）测定：另取2支10mL具塞试管,按下表取样.吸取提取液0.1mL（做一重复）,放入具塞刻度试管中,加入5mL考马斯亮蓝G-250蛋白试剂,充分混合,放置2min后用1cm光径比色杯在595nm下比色,记录光密度OD595nm,并通过标准曲线查得待测样品提取液中蛋白质的含量X（μg）.以标准曲线1号试管做空白.
表3 待测液蛋白质浓度测定
管号 13 14
蛋白质待测样品提取液（mL） 0.1 0.1
蒸馏水（mL） 0.9 0.9
考马斯亮蓝G-250试剂（mL） 5 5
OD595nm
蛋白质含量（μg）
五、结果计算
样品蛋白质含量（mg∕g鲜重）=(C×V/a)/W
式中：C为查标准曲线所得每管蛋白质含量（mg）；
V为提取液总体积（ml）；
A为测定所取提取液体积（ml）；
W为取样量（g）.

不是用什么做参比，而是先要绘制标准曲线。再通过待测蛋白质溶液的吸光度，查标准曲线，找出对应的蛋白质含量。
具体方法请参考：
植物体内可溶性蛋白质含量的测定:考马斯亮蓝G－250染色法：
http://www.bbioo.com/bio101/2005/4794.htm
另外，可详见：http://baike.baidu.com/view/1362725.htm?fr...

全部展开

不是用什么做参比，而是先要绘制标准曲线。再通过待测蛋白质溶液的吸光度，查标准曲线，找出对应的蛋白质含量。
具体方法请参考：
植物体内可溶性蛋白质含量的测定:考马斯亮蓝G－250染色法：
http://www.bbioo.com/bio101/2005/4794.htm
另外，可详见：http://baike.baidu.com/view/1362725.htm?fr=ala0_1#3

收起

用蒸馏水作替代蛋白质做对照就可以。考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质通过范德华键结合后，变为蓝色，且在蛋白质一定浓度范围内符合比尔定律，可在595nm处比色测定。2—5分钟即呈最大光吸收，至少稳定1小时。