作业帮我现在要做荧光定量PCR,有3个目的基因,以ACTIN基因作为内参,分析其在根茎、根、茎、叶的表达情况,现在我不清楚应该怎么做,具体步骤是怎么样,我用的是SYBR® Premix Ex TaqTM这个试剂盒,电泳
来源：学生作业帮助网 编辑：作业帮 时间：2024/11/29 10:50:24
我现在要做荧光定量PCR,有3个目的基因,以ACTIN基因作为内参,分析其在根茎、根、茎、叶的表达情况,现在我不清楚应该怎么做,具体步骤是怎么样,我用的是SYBR® Premix Ex TaqTM这个试剂盒,电泳
我现在要做荧光定量PCR,有3个目的基因,以ACTIN基因作为内参,分析其在根茎、根、茎、叶的表达情况,
现在我不清楚应该怎么做,具体步骤是怎么样,我用的是SYBR® Premix Ex TaqTM这个试剂盒,
电泳时目的条带单一，退火温度也确定好了，现在问题是应该用相对定量的标准曲线做好，还是用CT值比较法，而且这两种哪种比较简单，具体步骤是怎样
我现在要做荧光定量PCR,有3个目的基因,以ACTIN基因作为内参,分析其在根茎、根、茎、叶的表达情况,现在我不清楚应该怎么做,具体步骤是怎么样,我用的是SYBR® Premix Ex TaqTM这个试剂盒,电泳
1,首先需要根据三个目标基因及Actin的序列设计四对引物,引物设计原则同普通PCR引物,网上有很多介绍的,最好其中一个引物是结构基因部分序列+内含子部分序列这种模式.序列长一些25++,退火温度高一些（一般检测时常会60℃附近做两步法扩增）,尽量选择错配情况少的引物组合.许多软件,如primer primer 5可以协助做引物设计.扩增产物150-200bp左右.有可能不是一次成功的,所以跟导师申请的时候提前说好重新合成引物的可能比较大.
2,从各部位的新鲜样品中提取RNA、检测RNA、反转录不需要说的吧?Trizol试剂是用的很频繁的RNA提取试剂,效果不错.上海生工、大连宝公司的我都用过,都不错.最好买商品化的RNase-free耗材和水.
3,引物合成完了,需要做融解曲线,判断PCR扩增是否具有很好的特异性,如果怎么做条件优化,扩增都不是特异性的,那就需要重新设计引物.怎么做融解曲线网上也有很多教程.
4,如果融解曲线比较漂亮,就可以正式检测你的样品了.
还是建议你改用taqman法做定量分析,SYBR法总不踏实,需要不少实验来证实自己的定量分析数据是特异性扩增的结果.
如果你的实验设计中有阴性和阳性对照或者是要做组间对比，就做半定量，因为即使你做了全定量，最后需要对比的时候也回到了相对关系的倍比值，只不过绕了一大圈。 半定量比较简单 不需要做标准曲线，做标准曲线又要浪费24个孔，如果你是用96孔的话 看你的描述，应该是4个分组，做3个目的基因允许有6个复孔 或者减少复孔量每个目的基因设计2-3个引物，因为引物很便宜，选择溶解曲线最好的做。 开始做都会出现复孔不稳定的情况，做几次操作熟练了复孔数值稳定之后就可以不用复孔了，直接把组内样本一个个上上去。 关于数据分析，实时荧光定量PCR仪会自带分析软件，设置好对照和内参，如果有同组样本还需要设置biological group，然后选择样本点分析按钮一切OK 哦 还要补充一点，枪，枪头，八联管，EP管一定要用进口的，否则挂壁的试剂的价值远远超过进口耗材的价值，更关键的是浪费样本原料和时间。
一般都是采用CT值比较的方法相对定量，根据内参校准，得到一个relative quatity相对量，就行了，目前为止还没有遇到需要外标曲线进行绝对定量的情况。
不好意思，我不做这个！